譯者後記
蔡蘊明 老師 (於2020年十月十日)

取材與整理自：The Heroes of CRISPR by E. S. Lander Cell, 2016, 164, p18

CRISPR的發現與發展簡史

三日前諾貝爾化學獎的揭曉，彰顯了目前基因剪輯技術中的翹楚CRISPR/Cas9的發展中，佔關鍵地位的兩位科學家之貢獻。然而在為她們慶賀的同時，更不應該忘記在整個技術發展的背後，其他亦具有重要貢獻的科學家們。為此，筆者特別依據哈佛大學教授Eric S. Lander為該項發展，於2016年在頂尖期刊Cell上所發表的一篇名為「CRISPR的英雄們」之回顧文章，整理出一個有關CRISPR發現及發展的軌跡給讀者參考。

由於這項技術牽涉到美國東西兩岸學術重鎮專利的爭議，有不少人認為Lander教授的這篇文章論點太過偏袒，充其量只能視為一個波士頓論點。但筆者認為Lander教授在該文一開始就說明了，其觀點乃基於已發表之論文、個人訪談和其它包括期刊拒絕信等材料，因此純粹從各事件發生的順序來看，引經據典仍有參考價值。或許為了平衡意見，道納(Doudna, J. A.)與S. H. Sternberg於2017年合著了一本針對道納發展此項技術的心路歷程之書(A Crack in Creation: Gene Editing and the Unthinkable Power to Control Evolution)。即便如此，仍不免遭受批評(見Nature 546, 30–31 (2017))，引出道納回應(Nature 547, 162 (2017))。

本文的歷史回朔從CRISPR的發現開始，結束於該技術能運作於動物細胞為止，在那之後開始了爆炸性的發展，就不再贅述。還望讀者跳脫爭議，從一個感激的角度來領會整個發展。筆者一貫的看法是任何重要的科技發展，都不是一蹴可幾的，背後許多科學家前仆後繼的努力，才是真正成功的要件。(相關文獻請參考Lander原文)

發現

Mojica, F.：一位西班牙學者(University of Alicante)。

• 1989        開始於其博士班工作中研究一種西班牙海邊的古菌。
• 1993        發表其發現，在此菌的基因中存在一個重複多次的序列，是由30個鹼基所組成，且此序列概略具有迴文(roughly palindromic)的特性，而在這些重複序列(repeats)之間，具有約36個鹼基的間隔序列。之後也發現此現象存在於一些其它菌種中(1987年日本的Ishino等人也發現過) 。
• 1995        畢業時又進一步發表相關研究。
• 2000        至此時已經發現20種不同微生物均有此重複序列(後稱為CRISPR)，接著有人在此序列附近發現CAS基因(CRISPR associated genes)。
• 2003        開始轉移注意力到CRISPR的間隔序列(spacers)，終於在一種P1噬菌體基因中找到相同的序列，這種噬菌體容易感染大腸桿菌(E. coli)，但是具有此間隔序列的大腸桿菌卻不會被此噬菌體感染。進一步又找到許多相同的現象，因此他提出了一個假說：這是一種適應性免疫系統 (an adaptive immune system)。
• 2005        二月一日經過一年多折騰才得發表其研究結果。

Vergnaud, G.：一位法國學者，在法國國防部工作。因應90年代伊拉克戰爭挑起的生物戰劑威脅，研究1964-1966年越戰時期的瘟疫菌株，在其中亦看到CRISPR，並發現其中的間隔序列與一種噬菌體的基因序列相符。

• 2005        三月一日發表，認為那是過去對抗噬菌體的記憶。

Bolotin, A.：一位移民至法國的俄裔學者，在一農業研究中心工作。

• 2005        九月發表類似看法，更細部推測其運作機制，認為那是為了抑制噬菌體RNA。

實驗證據

CRISPR如何提供適應性免疫能力以及核酸酶(切割核酸的酵素)？

Horvath, P.：在法國西部一家出產及優格及起司的食品公司做研究。

Barrangou, R.：在美國Danisco公司。

Moineau, S.：一位加拿大Laval大學研究噬菌體的專家。

Horvath於2002年得知CRISPR，2005年決定與另二人合作以實驗證實適應性免疫能力的想法。

• 2007        發表研究結果，在實驗上證實被噬菌體感染過的菌株且具有抵抗力者，在菌株的間隔序列中存在該噬菌體的基因序列，且抵抗力愈強者其間隔序列愈多。他們也研究了CAS基因，發現CAS7與建立新的重複序列與間隔序列相關，與免疫力無關。但CAS9則與製造核酸酶有關。

轉殖CRISPR的程式

Van der Oost, J.：在荷蘭Wageningen大學。

Koonin, E.：在美國NIH工作。

• 2008       發表合作的研究，展示轉殖一段設計的間隔序列於CRISPR間，能成功的抵抗相對應的病毒，證據顯示其運作是針對DNA的切割。

確認CRISPR針對DNA的切割

Marraffini, L.：芝加哥大學畢業，於西北大學做博士後研究。

Sontheimer, E.：西北大學教授。

• 2008        實驗完全證實CRISPR運作是針對DNA的切割，申請專利但後來放棄。此時他們已指出利用此系統切割含有24-48個特定核苷序列的DNA應該很有用。

Cas9的運作需要crRNA的引導

• 2010        由Moineau等人的團隊發現。

發現tracrRNA

Charpentier, E.：當時在瑞典 Umeå大學。

Vogel, J.：在德國 Wurzburg 大學。

• 2011        發現另一個由25個鹼基組成的RNA且其序列與crRNA互補。
• 2012        發現此tracrRNA對於DNA的切割也極為重要。

於此階段CRISPR的運作機制已經大致明朗。

 

複製CRISPR系統於試管中

Silksnys, V.：在立陶宛的Vilnius大學。

• 2012        在試管中成功建立CRISPR系統並申請了專利，論文於四月送至Cell未被接受，五月改送PNAS而於九月發表。展示只需要CAS9 + crRNA + tracrRNA + RNase III，可用自行設計的間隔序列切割DNA，crRNA可縮減至20個鹼基。

Daudna, J.：美國加州大學柏克萊分校的教授，為RNA專家，於2011年起與Charpentier合作。

• 2012        發表非常類似的研究，6/8送出文稿，6/28就被Science期刊接受。

在哺乳類細胞中用CRISPR系統做基因剪輯

Zhang, F.：在美國波士頓的Broad Institute，於2011聽聞CRISPR，四月開始在人類胚胎腎臟細胞得到一點成功。

• 2013        十月發表(2012十月送出)成功的哺乳類基因剪輯。